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【组培仪器】影响山茱萸科植物组织培养的主要因素

作者:腾昊组培室 发布时间:2018-11-12 10:04 浏览次数:

文章来源:腾昊组培室

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  将植物的离体器官、组织和细胞等放在培养基上进行培养,使其逐渐增殖、分化,并发育出完整的小植株是一个相当复杂的过程,其形态发生的过程必然受到许多因素和条件的影响制约。组培仪器-腾昊为大家介绍:外植体、基本培养基和植物激素起到的关键性作用。

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  1、组培仪器-腾昊详解外植体

  1.1.1外植体选择

  在植物组织培养中,外植体的选择是终培养能否成功的关键因素之一。外植体供体植株的发育阶段、年龄、生长环境及外植体取材部位等的不同均可导致外植体生理状态的差异,从而影响组织培养的形态发生。

  山茱萸科大部分树种都以茎尖、带芽茎段等为外植体,通过器官直接发生途径获得再生植株,通过这种方式获得的植株遗传变异小,能保持亲本的特性。其中,峨眉四照花(C.capitanavar.emeiensis)的幼嫩茎尖、红瑞木的茎段就容易诱导不定芽。

  愈伤组织的诱导常选用叶片、茎尖、茎段、花托、花柄、顶芽等作为外植体。峨眉四照花、灯台树、山茱萸、角叶鞘柄木(T.angulata.var.intermedia)的叶片均已成功诱导愈伤组织。曾用峨眉四照花茎尖诱导产生大量愈伤组织,诱导率达80.0%,但仍未进行下一步的分化研究。对山茱萸的花托、花柄进行愈伤组织的诱导,诱导率分别为100%、96.2%,将诱导出的愈伤组织进行增殖培养,大量增殖后部分可分化出不定芽,分化率可达54.8%。

  体胚发生适合用未成熟的外植体诱导。利用大花四照花的未成熟合子胚,在MS或SchenkandHildebrandt(SH)培养基上,以3(或5)mg/L2,4-D+1.0mg/LKT的激素配比组合成功诱导出胚状组织,但后并未成苗。

  1.1.2外植体消毒

  对外植体材料进行合理有效的消毒处理,是植物组织培养工作的重要环节。外植体是有生命的植物材料,因此要求在消毒过程中既能有效杀灭微生物,又不能损伤植物组织。外植体消毒主要采用化学药剂进行表面消毒,其关键在于灭菌药剂的选择和消毒时间的把握。不同的外植体类型和不同的取材时期导致灭菌药剂的选择和消毒时间的确定存在一定的差异。对野外采集的峨眉四照花外植体用饱和漂白精溶液+吐温-80法处理10min,污染率较低,且植株褐化现象较轻。在山茱萸科组织培养试验的研究过程中,常用的灭菌组合为70%~75%酒精和0.1%升汞,消毒时间则因材料不同各异。其中,在对金叶红瑞木外植体进行消毒时发现,用70%酒精20s+0.1%升汞8min组合污染率与褐化率降为低。在灯台树组培快繁的试验中比较了84消毒液(有效氯含量为4.8%~6.2%)及酒精和升汞组合的灭菌效果,结果显示20%84消毒液灭菌15min外植体成活率高,为96.7%。

  2、组培仪器-腾昊详解基本培养基

  山茱萸科植物组织培养常用的基本培养基有:woodyplantmedium(WPM)、MS、1/2MS(MS中的大量元素减半)、B5和DKW等,其中常用的是WPM和MS。

  WPM、MS、1/2MS、DKW、M(MS培养基添加CaCl21200mg/L)、1/2M培养基等可用于不定芽的直接诱导。狭叶四照花于WPM培养基上成功完成了不定芽的诱导、增殖与生根;用WPM培养基对大花四照花幼苗的茎段和顶端分生组织进行的组织培养首次获得了成功,诱导出丛生芽并获得了生根植株;MS培养基则应用于峨眉四照花、红瑞木、山茱萸等植物的不定芽诱导。发现用DKW培养基诱导光皮梾木的带芽茎段产生不定芽的效果好,褐化程度低;WPM、M和1/2M培养基分别用于灯台树不定芽的诱导、增殖与生根。

  MS和B5培养基等可用于愈伤组织的诱导。峨眉四照花茎尖在MS培养基上诱导产生了大量愈伤组织,诱导率达80.0%;同样灯台树叶片在MS培养基上也诱导出了愈伤组织,诱导率高达100%;B5用于诱导角叶鞘柄木的愈伤组织。

  MS与SH培养基等可用于胚状组织的诱导。大花四照花通过体胚发生途径在MS和SH培养基上添加植物生长调节剂2,4-D以及2,4-D与KT的组合,成功诱导了胚状组织。

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  3、组培仪器-腾昊详解植物生长调节物质

  1.3.1对不定芽诱导与增殖途径的影响

  外植体通过直接器官发生途径产生不定芽是相对快捷的方式。在植物组织培养的过程中,外源激素对外植体材料的形态建成与调控起着十分重要的作用,其不同种类的选择和浓度的配比又影响着植株的再生频率和再生方式。山茱萸科植物较易诱导不定芽,各种植物生长调节物质的综合作用尤其是激素浓度的配比对不定芽的诱导和增殖有很大的影响。

  植物细胞分裂素6-卞氨基嘌呤(6-BA)、6-糠氨基嘌呤(KT)、玉米素(ZT)与植物细胞生长素3-吲哚丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)或α-萘乙酸(NAA)等的特定组合及浓度配比可用于该科植物的不定芽诱导。以MS为基本培养基,较高浓度的激素水平可用于难以诱导出芽的树种;反之,较低的浓度则可用于易诱导出芽的树种,如,用2.0mg/L6-BA和0.5mg/LIBA以及2.0mg/L6-BA和1.0mg/LIBA可诱导峨眉四照花的茎尖产生不定芽;0.5mg/L6-BA和0.1mg/LIBA可诱导红瑞木茎段的不定芽。以1/2MS为基本培养基,0.5mg/L6-BA+1.0mg/LIBA可用于偃伏梾木叶片的诱导,再生频率高达100%,不定芽在添加0.5mg/L6-BA+0.25mg/LIBA后能有效增殖;0.5~1.0mg/L6-BA+0.05~0.10mg/LIAA可诱导山茱萸的幼胚产生不定芽,其中平均每个幼胚可分化出6.7个芽,然后将6-BA与IAA的浓度降低1倍,再添加0.5~1.0mg/LGA3可进行增殖培养,增殖系数为2.5[39];1.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBA可诱导山茱萸茎段萌发腋芽。以WPM为基本培养基,1.0mg/L6-BA可诱导大花四照花丛生芽的增殖;狭叶四照花诱导与增殖的植物激素分别为1.0mg/L6-BA+0.05mg/LKT+0.1mg/LNAA和1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA,萌发率达到86.29%,增殖系数为4.07;0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+1.0mg/LGA3有利于灯台树新梢的启动;2.0mg/L6-BA+0.1mg/LZT+0.1mg/LNAA可使山茱萸的茎段侧芽形成丛苗。以M为培养基,0.5mg/L6-BA+0.05mg/LIBA可用于红瑞木不定芽的增殖培养,增殖率为73.5%,增殖系数为2.32;对于灯台树,适宜的增殖激素组合为1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+2.0mg/LGA3,平均增殖系数为4.4;以DKW为培养基,0.5(或1.0)mg/LZT+0.1mg/LIBA可用于光皮梾木不定芽的诱导,平均出芽数量为2.12,而0.5mg/LZT+0.1mg/LIBA则可使其不定芽增殖系数达高,为4.22。

  1.3.2对愈伤组织诱导与分化途径的影响

  山茱萸科植物外植体还可通过器官间接发生的途径产生再生植株,即先经过脱分化形成愈伤组织,再进一步分化形成不定芽。

  6-BA和IBA、NAA、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等常用于该科愈伤组织的诱导与分化。其中NAA和2,4-D对愈伤组织的诱导具有十分重要的作用。以MS为基本培养基,2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA可诱导峨眉四照花的茎尖产生大量愈伤组织,诱导率达80.0%;0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA可使灯台树的叶片出愈率达100%,其愈伤组织质地松软,米白色至浅绿色,生长良好。以1/2MS为基本培养基,经研究发现,有利于山茱萸叶片愈伤组织诱导的激素组合为1.0mg/L6-BA+0.5~1.0mg/LIBA,2,4-D则适于花柄、花托愈伤组织的形成,例如1.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D可诱导花柄、花托产生愈伤组织,其中花托的出愈率达100%;通过试验证明,1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA是诱导山茱萸叶片产生愈伤组织的佳组合;从试验中得出,0.5~1.0mg/L激动素(KT)+0.05~0.50mg/LNAA对山茱萸叶片、顶芽、幼果、果柄等产生愈伤组织的诱导效果十分显著,并指出NAA浓度越高,愈伤组织产生量就越大。以B5为基本培养基,角叶鞘柄木在激素组合0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D中产生愈伤组织且生长良好。

  1.3.3对体胚发生途径的影响

  从近几十年的研究结果来看,对山茱萸科植物体细胞胚胎发生的研究较少。2,4-D和KT等植物生长调节剂可用于体胚发生。利用大花四照花的未成熟合子胚,以MS或SH为培养基,3(或5)mg/L2,4-D+1.0mg/LKT完成了对胚状组织的诱导,但后并未成苗。

  1.3.4对壮苗和生根的影响

  影响植物离体培养过程中壮苗和生根的因素有很多,包括外植体自身的生理生化状态,也有外部的多种因素,如基本培养基、植物激素、培养途径、光照、pH值和温度等的影响。

  芽苗的生根与它的健壮程度有关,即生根前的壮苗培养很有必要。山茱萸科植物壮苗和生根培养所选用的植物激素有IBA、NAA、钾盐吲哚丁酸(KIBA)等。以1/2M为基本培养基,0.5mg/LIBA可使红瑞木生根率达91.7%,移栽成活率达78.9%;3.0mg/LIBA可诱导灯台树生根,暗培养10d,生根率为60.0%。以1/2MS为基本培养基,0.5mg/LIBA可诱导偃伏梾木生根;1.0mg/LIBA+0.1mg/L6-BA可使山茱萸生根率达60.0%以上。以WPM为基本培养基,1.0mg/LIBA可诱导大花四照花生根;1.0mg/L6-BA+0.1mg/LZT+0.5mg/LGA3+0.1mg/LNAA有利于山茱萸的丛苗进行壮苗培养;以DKW为培养基,1.0mg/LKIBA可诱导光皮梾木生根,生根率高达93.3%,平均根长有2.8cm。

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  4、组培仪器-腾昊详解炼苗与移栽

  组培苗是在恒温、保湿、营养丰富、光照适宜和无病虫害侵染的优良环境中生长的,其组织发育程度不佳,抗不良环境能力差。移栽时,由于环境条件变化,常会因组织失水和病菌感染而引起组培苗死亡。因此,移栽时要重点防失水、防感染。移栽前3~7d,打开瓶盖炼苗,炼苗后用自来水洗掉根部培养基,以防病菌感染。

  已报道的山茱萸科植物组培苗移栽成活率为70%~100%。灯台树的炼苗时间为3d,移栽于消毒的混合基质中,用水浇透,置于20~25℃的温室内,湿度保持在90%以上,试验得出以蛭石∶珍珠岩=1∶1(体积比)为移栽基质成活率高。狭叶四照花在炼苗7d移栽至草炭土∶蛭石(1∶1)的基质中培养成活率高。

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