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广藿香的组培快繁技术研究

作者:组培仪器 发布时间:2019-10-18 09:52 浏览次数:

文章来源:组培仪器

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  广东省遂溪县乌塘镇地处雷州半岛北部,螺岗岭脚下,110°00′15″E,21°16′14″N。属于亚热带气候,雨量充沛、长年无霜,土地肥沃,有雷州青运河横贯全镇,还有两条自然河流贯穿,灌溉便利,非常适合广藿香生长。自1960年起,当地群众开始种植广藿香,广藿香是当地传统的经济作物,药效佳,销路广、效益高。随着种植规模不断扩大,传统的剪枝扦插种植模式虽然简单易行,但长期采用扦插繁殖,引起植株生长缓慢、参差不齐,且病虫害发生率高、抗逆性弱,单位产量低。故采用新的繁殖方式以助提高广藿香的品质和产量的必要性。喻良文等在做不同繁殖方式的广藿香药材挥发油分析表明,用组织培养繁殖与扦插繁殖的遂溪广藿香,其挥发油差异微小。因此,研究广藿香种苗组培快繁技术,可为今后遂溪乌塘镇广藿香种植的种源提纯、优化以及工厂化育苗提供技术基础。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  (1)以乌塘镇生长健壮、无病虫害的优良广藿香(以下简称乌塘广藿香)单株芽条作外植体。

  (2)外植体诱导分化与芽增殖培养基:均采用MS基本培养基+适量细胞分裂素和生长素;添加3%白糖、0.6%琼脂,pH 值为 5.8。

  (3)生根培养基:1/2MS+适量生长素。添加3%白糖、0.5%琼脂,pH 值为 5.8。

  1.2 方法

  (1)外植体选择与消毒处理:在天气条件良好时,选择生长健壮、无病虫害的优良单株幼嫩茎段,用自来水冲洗30min.,在无菌条件下用75%酒精浸泡8~10s,再用0.1%升汞加2滴吐温-80溶液浸泡,按不同时长分别处理,4、6、8、10、12、14min.,无菌水冲洗各5次,然后切成2~3cm带节小段,接种于诱导培养基上。

  (2)培养条件:培养室温度为28℃,光照约2500Lx,光照时间约14h/d(外植体诱导和材料增殖转接采用暗培养7d)。

  (3)外植体诱导:将不同消毒处理后的外植体接种于诱导培养基,诱导培养基采用MS培养基+6-BA1.0m g/L+N AA0.2m g/L组合,每个处理接种40个外植体,比较外植体的污染、褐化情况。外植体接种大约20d左右,没有褐变和污染的外植体节间萌发出小芽。

  (4)增殖培养:将诱导出的芽转接到增殖培养基中开始扩繁,转入增殖培养阶段。增殖培养阶段,不同浓度的6-BA和NAA组合对乌塘广藿香丛芽增殖的效果进行比较。以乌塘广藿香丛芽在不同培养基中转接3次(每次以25d为一个周期)后的生产情况进行观察和分析。6-BA浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0.mg/L,NAA 浓度为 0.1、0.2、0.5mg/L,每种培养基分别接种20个芽。

  (5)生根培养:生根阶段采用1/2MS培养基,然后对NAA和IBA在芽苗诱导生根过程中的效果进行比较。分别设 NAA 浓度为 0.2、0.5、1.0、2.0m g/L,IBA浓度为 0.2、0.5、1.0、2.0mg/L,每种培养基分别接种100株苗,比较生根情况,25d后统计生根指标。

  (6)试管苗移栽:把不同生根培养基中诱导生根的试管苗炼苗后,移栽到泥炭土、椰糠、珍珠岩、谷壳的混合基质中,30d后比较成活率和生长情况。

  2 结果与分析

  2.1 外植体消毒处理

  从表1可知,升汞消毒时间对外植体的污染率和褐变率影响非常明显,消毒时间低于4min.污染率达100%,消毒时间超过14min.后,褐变率达100%。而消毒时间为8min.时,诱导成功率高,诱导率达51%。这一结果与伍彧、李明的实验发现[4]基本吻合,但与叶片做为外植体时的结果有较大差异。

  表1 不同消毒处理时间对外植体诱导成功率的影响

  Table 1 The effect of different disinfecting time in the success rate of ex-plant induction

  


  2.2 不同浓度的生长素和细胞分裂素对广藿香丛芽增殖的影响

  没有褐变和污染的外植体在诱导培养基中培养10d左右,节间处开始萌发出芽点,继续培养15d左右,芽点长成长度大约2cm的嫩芽后,将其从外植体切下转接到新的增殖培养基中培养,从而进入继代苗增殖阶段。增殖培养基选择不同浓度的6-BA和NAA进行比较,挑选合适的增殖培养基。

  表2 不同激素水平对增殖培养的影响

  Table 2 The effect of different hormone levels in the tissue culture and propagation

  


  从表2显示,激素浓度对乌塘广藿香的增殖培养影响很大,尤其是6-BA的浓度对芽苗的增殖起着决定性的影响。M1和M2(6-BA浓度为0.2m g/L)培养基中,芽苗增殖率相对较低,但苗木长势较好。M3、M4、M5(6-BA浓度为0.5m g/L)培养基中苗木生长都较好,尤其是M4,苗木高度比较一致,而且生长良好,适合进一步扩繁。M6、M7、M8(6-BA浓度为1.0m g/L)培养基中,苗木增殖率较高,但苗木偏弱小,丛芽多,不利于壮苗培养。M9、M10(6-BA浓度为2.0m g/L)培养基中,苗木增殖率非常高,基本呈团簇状,芽都非常细小,不易分辨,也不利于转接和壮苗培养。在以上几种培养基中,NAA的浓度对苗木生长的影响不是很明显。

  2.3 不同生长素对广藿香组培生根的作用

  乌塘广藿香组培苗扩繁到一定的数量后,就开始转入生根试验。将长度为1~1.5cm的芽接种于生根培养基中,25d后观察根数及生长情况,结果见表3。

  表3 不同激素水平对组培生根的影响

  Table 3 The effect of different hormone levels in the tissue culture rooting of Patchouli

  


  说明:根长及生根条数均取平均值

  由表3可以看出:在不同的生根培养基中,乌塘广藿香的生根率都很高,属于易生根的品种。随着IBA和NAA的浓度增加,乌塘广藿香的生根时间会逐渐加快,但太高的激素浓度会促进根部愈伤组织的产生,容易出现畸形苗,苗木生长不正常,甚至会停止生长。由于是易生根品种,相对较低的激素浓度对乌塘广藿香的生根培养比较有利。NAA和IBA对乌塘广藿香的生根效果相差不大,只是使用浓度对生根影响较大。通过比较,接种25d时,生根培养基S4的生根效果佳,即1/2MS+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L。2.4乌塘广藿香组培苗移栽及生长状况

  组培苗移栽前须进行驯化,即在自然光下炼苗5~7d,但需注意控制光照强度,以免光线太强灼伤组培苗。当驯化5~7d,叶片呈深绿色、苗木比较健壮时从培养瓶中取出小苗洗干净基部培养基,再用0.1%甲基托布津溶液浸泡消毒5min.后栽植于无纺布轻基质袋中。轻基质成分及比例为泥炭土:椰糠:谷壳:珍珠岩=3:3:2:2。移栽后注意保湿遮荫,成活率达95%以上。移栽成活后,注意水肥和病虫害的控制,60d左右苗高可达25cm左右,叶片在10对以上,即可出圃进行大田种植。

  3 结论与讨论

  (1)乌塘广藿香组培以健壮植株的嫩茎为外植体,诱导效果虽然较好,但诱导时的污染率还是偏高,污染率一般都在50%以上,这与广藿香的自生特性有关系,因为所取外植体表面覆盖一层绒毛,容易导致消毒不,而且茎段材质比较疏松,氯化汞容易进入细胞内部毒害导致外植体褐变死亡。需要进行更多的试验比较才能得出更好的外植体灭菌方法或者更适合的外植体材料。

  (2)乌塘广藿香的增殖培养基的选择主要通过调节6-BA用量来进行试验比较。总的来说低浓度的6-BA比较适合乌塘广藿香的增殖,高浓度的6-BA容易导致无效苗的大量繁殖,但其他的影响因子如温度、光照等对增殖的影响还需要进一步观察。研究结果表明,MS+2.0m g/L 6-BA+0.5m g/L K T+0.1m g/L IBA为合适增殖配方。

  (3)乌塘广藿香的组培生根相对比较容易,根系发育都比较好,但随着培养时间的延长,根系往往都比较长,根毛会逐渐增多,这导致培养基不容易清洗干净,增加清洗难度,会影响组培苗移栽的移栽效率,及移栽成活率,因此,生根培养基的优化试验还需要继续进行,直至找到根系数量和长度都合适的生根培养基。

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