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“金梗1号”组培快繁技术研究

作者:组培室规划设计 发布时间:2019-12-02 10:08 浏览次数:

文章来源:组培室规划设计

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  桔梗(Platycodon grandiflorum A.DC)为桔梗科多年生草本植物,以根入药,为《中国药典》所收载。中药桔梗性平,味苦、辛,归肺经,具开宣肺气,祛痰排脓之功效,临床用于治疗外感咳嗽,咽喉肿痛,肺痈吐脓,胸满肋病,痢疾腹痛等症。桔梗在我国分布广泛,南北方皆适于种植,安徽亳州地区近年来已形成了一定的种植规模。但在长期栽培过程中,笔者发现其品种混杂、良莠不齐,给生产管理带来了一定困难。亳州市皖北药业有限责任公司通过开展深入研究,成功培育出高产优良的桔梗新品种“金梗1号”,在河北、内蒙、北京等地已有示范推广,但种苗快速繁殖是当前需要解决的问题。

  采用组织培养方法建立无性繁殖系统可满足人们对种苗的大量需求,并有利于种质的保存,对新品种的推广具有重要意义。本实验以桔梗优良新品种“金梗1号”的茎尖为外植体,拟通过组织培养研究以获取大量脱毒试管苗。

  1 材料和方法

  1.1 材料来源 供试材料“金梗1号”采自安徽亳州,经安徽中医药大学中药教研室鉴定为桔梗(Platycodon grandiflorum A.DC),栽培于亳州市皖北药业有限责任公司实验苗圃。

  1.2 实验方法

  1.2.1 无菌材料的获得 取长势好的“金梗1号”顶芽和侧芽,剥去叶片,用洗衣粉洗去表面尘土,自来水冲洗1h,在超净工作台上,先用0.1%升汞浸泡12min,然后用无菌水冲洗4~5次。解剖镜下剥取0.2~1.0mm大小的茎尖分生组织,接种于MS+BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L固体培养基上。培养温度(25±1)℃,光照1200lx,每天16h,30d后继代1次,60d后获得无菌试管苗。

  1.2.2 快速繁殖培养基优化实验 为了试管苗的快速繁殖,采用L9(34)正交设计实验,考察不同浓度水平的6-卞基腺嘌呤(6-BA:0.2、0.5、1.0g/L)、萘乙酸(IAA:0.1、0.2、0.4mg/L)、病毒唑(RTCA:4.0、8.0、10.0mg/L)对丛生芽增殖的影响,每个处理10瓶,每瓶接种4株丛生芽,培养条件同上。30d后以丛生芽平均生长率[丛生芽平均生长率=(n天后材料重-接种时材料重)/接种时材料重]为衡量指标,筛选出适合“金梗1号”快速繁殖的培养基。实验因素水平见表1。

  表1“金梗1号”繁殖培养基筛选正交实验因素水平

  


  1.2.3 生根培养基优化实验 根据前期试验,1/2MS适合作为基本生根培养基。为了筛选“金梗1号”试管苗佳生根培养基,将继代培养的高约2~3cm的试管苗接种于培养基上,采用L9(34)正交设计实验,考察吲哚乙酸(IAA:0.1、0.3、0.5mg/L)、生根粉(ABT:0.0、0.1、0.2mg/L)、多效唑(PP333:0.1、0.3、0.5mg/L)对生根效果的影响。25d后以生根数为指标来进行统计分析。每个处理10瓶,每瓶5棵,培养条件同上。实验因素水平见表2。因根数过多,以长度超过8.0mm的根进行根数统计,根长低于8.0mm的根数计为0。

  表2“金梗1号”生根培养基筛选正交实验因素水平

  


  2 结果与分析

  2.1 茎尖分生组织大小对成活率的影响 茎尖分生组织成活率的高低与直径大小的关系见表3。从表3的试验结果可以看出,接种成活率与茎尖直径成正比。然而茎尖越大,所含病毒数也越多,脱毒效果越差。直径为0.2mm时成活率很低,而直径大于0.6mm时成活率可高达40%。但直径过小,分生组织所含细胞也少,降低了细胞进一步分裂分化的可能性。当茎尖直径为0.4mm时,虽然细胞生长分化受到一定限制,成活率为30%,但能取得较好的脱毒效果,因此本实验认为直径0.4mm的茎尖分生组织可以取得较好的培养效果。成活的茎尖经过60d左右培养即可直接分化形成试管苗植株。

  表3 茎尖大小与成活率的关系

  


  2.2 植物生长调节剂对丛生芽增殖的影响 由表4中的R值分析可以看出,3个因素对丛生芽平均生长率的影响次序为A(6-BA)>B(IAA)>C(RTCA),9种培养基中丛生芽平均生长率高的为16.59。表5方差分析结果表明,6-BA浓度对丛生芽平均生长率有显著影响,适宜的浓度为0.5mg/L,在此浓度下丛生芽增殖快;IAA浓度对丛生芽生长率有一定影响,适宜的浓度为0.2mg/L;病毒唑的影响较小。根据实验结果,“金梗1号”丛生芽繁殖的适培养基为A2B2C1,即MS+BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L+RTCA 2.0mg/L。

  表4 丛生芽繁殖培养基筛选的正交实验

  


  表5 试管苗繁殖的方差分析

  


  注:F1-0.01(2,2)=99.0,F1-0.05(2,2)=19.0,F1-0..1(2,2)=9.0。

  2.3 植物生长调节剂对试管苗生根的影响 以平均根长为观测指标,采用正交实验设计方法考察植物生长调节剂对试管苗生根的影响,结果见表6、表7。由表6中R值大小可以看出,3个因素对平均生根数的影响次序为A(IAA)>B(ABT)>C(PP333)。由表7的方差分析结果表明,IAA和ABT的浓度对平均生根数有显著影响,适宜的浓度分别为0.5mg/L、0.2mg/L,在此条件下试管苗平均根数多。而PP333生根数量的影响虽然很小,但不添加PP333,试管苗长势瘦弱,添加适量PP333后生长健壮。综上考虑,本实验中“金梗1号”试管苗佳生根培养基为1/2MS+IAA0.5mg/L+ABT0.2mg/L+PP3330.1mg/L。

  表6 试管苗生根培养基筛选的正交实验

  


  表7 试管苗生根的方差分析

  


  


  注:F1-0.01(2,2)=99.0,F1-0.05(2,2)=19.0,F1-0..1(2,2)=9.0。

  3 讨论

  “金梗1号”是亳州市皖北药业有限责任公司自主育成的桔梗新品种,产量高,品质佳。本实验以“金梗1号”为实验材料,采用现代生物技术中的组织培养方法建立快速繁殖体系,对于优良中药材的示范推广与品质保存具有现实意义。

  植物组织培养中的培养基筛选工作量大,所需实验次数多,牵涉到不同植物生长调节剂的浓度配比及种类。正交设计的特点是利用极差分析及方差分析可得出许多有价值的结论,而且所需实验次数较少[3]。本实验通过正交设计筛选“金梗1号”桔梗新品种的佳繁殖培养基、生根培养基,在提高了实验准确性同时减少了实验次数。

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