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植物组织培养中的染菌及预防

作者:腾昊组培室 发布时间:2018-12-20 11:21 浏览次数:

文章来源:腾昊组培室

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总结植物组织培养过程中常见的染菌现象及原因,分析污染的原因,并提出控制污染、建立洁净培养环境、无菌植株系统等措施,以提高组培育苗成功率。

组织培养是一种快速发展的植物繁殖技术,已在单倍体育种、细胞突变体筛选、种苗脱毒复壮、种质资源保存与交换、植物快速繁殖、工厂化育苗等方面得到广泛应用,并取得明显的成效。在组培过程中,无菌操作不规范,培养基、超净工作台、接种室消毒不都会引起组培苗污染带菌的问题,甚至会严重影响工作进度和生产效率,致使生产和科研试验失败,造成严重的经济损失。因此,在植物组培育苗中降低染菌率是极为关键的技术环节,其中无菌操作技术和经验积累至关重要。现将植物组织培养中的污染原因及预防措施总结如下。

植物组织培养

1 造成污染的原因

植物组织培养中染菌一直是制约植物组培育苗发展的主要因素,常见的病原是细菌和真菌两类。病菌的污染给育苗造成多方面的危害,尤其是内生细菌的感染危害更为严重。其主要表现是早期引起育苗失败、增殖率降低、培养苗生长缓慢、玻璃苗现象增多等,后期导致移栽试管苗困难或移栽后死苗。

1.1 细菌污染

细菌污染一般在接种后1、2 d即可发生。在培养过程中,培养基出现浑浊的水渍状,有时甚至整个培养材料周围出现黏液状物或发酵状的泡沫。在细菌污染中以芽孢杆菌污染为严重、为普遍,而且芽孢杆菌对紫外线和消毒剂有一定程度的抗性,能忍受一定程度的高温高压,常规的高温消毒、紫外线杀菌效果不理想。

细菌性污染形成的原因,一是由于接种材料带菌或培养基灭菌不,使得成批育苗材料受污染;二是因工作人员无菌操作不规范引起细菌侵染。

1.2 真菌污染

真菌污染一般在接种后3~8 d发生,主要是由霉菌感染。起初培养基污染的部位发霉,产生绒毛状菌丝,随后可产生黑色、白色、黄色、绿色的病原孢子。

真菌污染主要是周围环境带菌和空气不洁净造成的,如育苗环境不洁净、超净工作台过滤装置失效、育苗容器的开口太大、封口膜密封不严等原因。

2 预防措施

对于以上导致污染的各种因素,应着手从以下两方面来预防和降低污染。一方面应控制外植体内部带菌与外部带菌,内部带菌不容易灭菌,但可通过无菌培养室或温室内的预培养来控制;外生菌可以通过表面消毒的方法进行杀菌。另一方面应严格规范工作人员的无菌操作程序,降低操作环境染菌,可通过规范操作程序加以控制。

2.1 选择合适的外植体

正确选择外植体是植物组织培养取得成功的前提,一般一年生或者二年生的草本植物比多年生的木本植物带菌少;幼嫩的材料比老的材料带菌少;温室培养的植物比田间生长的植物带菌少;不带泥土的材料比带土的材料带菌少。避免在阴雨天采集外植体,强烈阳光可灭杀一些真菌和细菌。对于大多数植物来说,茎尖组织生长速度快、遗传性状稳定,病毒感染率低,所以茎尖组织是培育无毒苗的佳外植体。但是茎尖数量较少,因此生产中植物中上部的茎段组织也是较好的外植体。不同植物由于本身不同部位的生长特性不同,宜采集容易消毒和灭菌的部位,以降低污染带菌率。

植物组织培养

2.2 外植体消毒

外植体可能带有外生菌和内生菌,必须经消毒才能接种。外生菌可用表面消毒的方法灭菌,一般情况采用的消毒法:用75%酒精浸泡几秒至1 min后,再迅速浸入0.1%升汞溶液中5~10 min。一些难消毒的外植体要采用特殊的措施,如表面带有较多绒毛的外植体可用真空减压消毒,真空减压抽走绒毛下的空气,让消毒液更容易浸入,以增强灭菌效果。使用混合的消毒液或多次消毒的方法,也可增强灭菌效果。对于内生细菌,表面消毒无法灭菌,可采用分生组织培养或反复茎尖培养的方法来脱除,也可在培养基中添加抗菌素、降低pH值等方法来预防和控制内生菌的污染。

2.3 培养基灭菌

培养基与培养器皿的灭菌大都采用高压湿热蒸汽灭菌法以确保灭菌效果完全。灭菌过程中当压力升到0.5 kg/cm2时,开启放气阀将锅内冷空气排净,再关闭排气阀继续加热,压力上升到1.1 kg/cm2、121℃时,保持15~20 min即可。

2.4 接种过程严格灭菌

接种时工作人员应严格规范无菌操作,避免人为因素造成染菌。要定期检查超净工作台,定期对过滤器进行清洗与更换,避免操作区域带菌。内部的过滤器每隔一定时间要检测操作区的带菌量,如果发现过滤失败,则要整块更换。此外还需要测定操作区的风速,通过调压旋钮使操作区的风速达到无菌操作需要的每分钟20~30 m。操作人员要做到尽量少带菌,严格实验操作,接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。接种用的器具要经高温灭菌,每次使用后蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌。在超净工作台的操作范围内,不能放入过多的育苗材料,以免挡住气流。感染杂菌的培养瓶在灭菌处理后才能打开洗涤。脱毒培养所用的显微镜不能用高温高压灭菌,可用75%酒精擦洗显微镜表面,再放在操作台上用紫外灯杀菌。

2.5 环境消毒

不清洁的环境使培养的污染率明显增加,因此接种室与培养室应定期净化与消毒,接种前接种室和培养室应用紫外灯照射消毒30 min以上或用2%来苏水消毒,定期对接种室和培养室熏蒸或喷雾消毒。甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒效果较好,但是对人体存在一定的伤害,通常每年熏蒸2、3次。紫外线与臭氧对环境消毒效果好,且使用灵活简便,对人体的伤害较小。夏季、高温高湿的环境污染率较高,要求培养室的相对湿度应控制在70%以下。

植物组织培养

随着植物组织培养技术的快速发展,植物组培育苗的应用领域越来越广阔。在育苗过程中控制或降低污染是为关键的环节,既要保证控制污染的效果良好,又要力求外植体不受损伤或轻微损伤不影响生长。因此控制污染、建立洁净培养环境、无菌的植株系统是组培育苗的努力方向。

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