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白及组培苗繁育组织继代培养研究

作者:组培架 发布时间:2019-11-26 15:29 浏览次数:

文章来源:组培架

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  以白芨种子作为试验材料,通过不同的培养基处理,试验研究了白芨的组培快繁技术。试验结果表明:①不同基本培养基对白芨种子萌发的影响,在诱导白芨种子萌发时,低盐的1/2MS作为种子萌发的基本培养基,更有力于种子萌发。而在白芨进行丛芽增殖的时候,富含更多盐分的MS则更加适合,能够提供更多的养分;②不同的植物激素对白芨组培的影响,不同的外源激素及不同的浓度对白芨组培各阶段的影响均不同,种子萌发好用NAA1mg /L、丛芽增殖培养较适宜6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L、壮苗生根较适宜NAA0.5mg /L。

  1 引言

  白芨为兰科白芨属多年生草本植物。分布在河南、陕西、甘肃、浙江、福建、四川、贵州、云南等地。白芨块茎入药,具有收敛、补肺止血、消肿生肌等广泛的药用价值。白芨市场需求量较大,但由于人们长期的采挖导致野生资源愈来愈少,濒临灭绝,而常规的分株繁殖,繁殖系数低,难以满足市场需求,本实验选用白芨种子进行无菌播种,获得无菌苗后建立快繁体系,为规模化生产优良种苗奠定基础。

  2 试验设计

  (1)试验仪器:电子天平,超净工作台,高压灭菌锅等。

  (2)试剂:基本培养基(MS,1/2MS),植物外源激素(萘乙酸,6-苄氨基嘌呤),蔗糖,琼脂,消毒试剂(HgCl2,酒精)等。

  (3)培养材料:白芨种子。

  (4)基本药剂和培养基。

  试验设计采用MS和1/2MS两种基础培养基和不同激素配比的培养基,附加蔗糖3%,琼脂0.65%,pH为5.8~6.0。

  诱导白芨种子萌发培养基采用3个不同配比做对比:①1/2MS2.47 g/L+NAA1 mg /L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;②MS4.74 g/L+NAA1 mg /L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;③1/2MS2.47 g/L+6-BA1 mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L。

  白芨丛芽增殖培养基采用4个不同配比做对比:④1/2MS2.47 g/L+6-BA1.0 mg/L+NAA0.15 mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;⑤MS4.74 g/L+6-BA1.0 mg/L+ NAA0.15 mg/L + 琼脂6.5 g/L+ 蔗糖30 g/L;⑥MS4.74 g/L+6-BA1.0 mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;⑦MS4.74 g/L+ NAA0.15 mg/L+琼脂6.5 g/L+ 蔗糖30 g/L。

  壮苗生根培养基采用3个不同配比做对比:⑧1/2MS2.47 g/L+NAA0.5 mg /L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;⑨1/2MS2.47 g/L+NAA1 mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L;⑩1/2MS2.47 g/L +NAA1.5 mg/L+琼脂6.5 g/L+蔗糖30 g/L。

  3 试验方法及过程

  (1)环境消毒。将组培操作室、培养室清洁消毒,然后将操作室内及洁净工作台上的紫外灯开启照射消毒30min,保证工作台工作区内处于无菌环境。

  (2)外植体消毒。选取较饱满的白芨种子用少量洗衣粉水清洗干净,在超净工作台上采用70%乙醇消毒30 s,无菌水冲洗后用0.1%升汞消毒15 min,再用无菌水冲洗3~4次,用无菌滤纸把水分吸干。从果实中部剥开,取出种子,迅速接种到配置好的培养基上。

  (3)培养基配制。按照试验设计,根据不同阶段各个培养基配方的不同处理,分别称取各个成分并加入少量水加热完全溶解后,混合定溶,调节pH值,分装到组培瓶内,连同接种用具一起进行高温灭菌。在121 ℃高温蒸汽灭菌30 min后冷却备用。

  (4)接种。做好器具及双手消毒后,在超净工作台里按无菌操作要求打开瓶盖,用镊子夹取适量上述准备好的种子,均匀撒落在培养基上,并盖好瓶盖。

  (5)培养室培养。将接种好的组培瓶移至组培室内组培架上进行培养,培养环境条件设定为:温度25±1 ℃,光照1000~1500 Lx,光周期为14 h。

  培养2个月后培养基养份耗尽并且小苗过密,更换培养基转接到丛芽增殖培养基并进行分瓶,更换培养基瓶后继续培养2个月左右再转接至壮苗生根培养基上进行培养。前后总共培养大约7个月左右,即可出瓶炼苗。

  4 炼苗移栽

  炼苗移栽基质采用透气性和保湿性较好的珍珠岩、蛭石、松树皮、泥炭土等。移栽前在大棚室内炼苗3~5 d,提高抗性和适应性。将小苗根部的培养基清洗干净,移栽到准备好的基质中。适度遮荫,湿度保持在80%左右,待组培移栽苗新叶展开和新根长出后,即可按常规管理。

  5 结果分析

  通过不同成分配比培养基的试验比较,认真观察记录各个阶段白芨在培养基上生长表现状况,分析白芨种子萌发增殖生根表现佳的培养基,试验结果见表1。

  表1 4个不同配比的培养基对苗高的影响-方差分析

  


  表1的结果表明F>Fcrit,差异显著,说明编号为④、⑤、⑥、⑦这4种不同培养基的对苗高的影响有显著的差异。

  表2 3种不同浓度NAA对诱导白芨苗生根的影响-方差分析

  


  表2的结果表明F>Fcrit,差异显著,说明编号为⑧、⑨、⑩这3种不同培养基对生根的影响有显著的差异。

  根据白芨组培苗在各个阶段不同培养上的生长表现状况,进行综合评价分析,表现较好的用+++表示,一般的用++表示,相对较差的用+表示。结果如表3。

  表3 白芨组培各阶段不同培养基表现状况汇总

  


  结果表明:在相同培养条件下,种子的萌发率及长势对比可见①>②、①>③,说明MS, 1/2MS这两种常用的基本培养基中,1/2MS培养基更有利于白芨种子的萌发。NAA,6-BA这两种外源激素对比,NAA更利于白芨种子萌发;增殖培养中⑤>④、⑤>⑥、⑤>⑦,说明MS, 1/2MS相比,MS更有利于白芨的增殖生长,外源激素同时加6-BA和NAA对促进增殖生长的影响要强于只加其中一种;壮苗生根培养中⑧>⑨>⑩,说明低浓度的外源激素NAA更有利于诱导生根。本实验采用NAA作为诱导生根的外源激素,诱导出来的根较长、较粗壮,植株生根率为100%。移栽后成活率达到了70%左右(图1、2)。

  


  图1 接种一周后白芨种子萌发状况

  


  图2 清洗干净的组培苗

  6 结论

  6.1 不同基本培养基对白芨种子萌发的影响

  MS培养基盐分较高,而1/2MS的盐分相对较低,在诱导白芨种子萌发时,低盐的1/2MS作为种子萌发的基本培养基,更有力于种子萌发。而在白芨进行丛芽增殖的时候,富含更多盐分的MS则更加适合,能够提供更多的养分。

  6.2 不同的植物激素对白芨组培的影响

  通过试验表明:不同的外源激素及不同的浓度对白芨组培各阶段的影响都不同。种子萌发好的NAA1mg/L;丛芽增殖培养较适宜6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L ;壮苗生根较适宜NAA0.5mg/L 。

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